Nei test immunoblot, gli antigeni fissati su membrane vengono usati come fase solida per rilevare anticorpi specifici nei campioni dei pazienti. L'esecuzione del test può essere manuale, semi-automatica o completamente automatica. Se un campione contiene anticorpi specifici, questi si legano agli antigeni presenti sulla membrana. Nella fase successiva, viene aggiunto un anticorpo marcato con fosfatasi alcalina (AP) (coniugato), che si lega agli anticorpi specifici. La fosfatasi alcalina catalizza una reazione cromatica con il nitro blu tetrazolio cloruro/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT/BCIP) aggiunto successivamente. Se nel campione del paziente sono presenti anticorpi specifici, appare una linea scura in corrispondenza della posizione dell'antigene. L'intensità della colorazione è proporzionale alla concentrazione di anticorpi nel campione.